Kui katse ebaõnnestub, kas olete kunagi osutanud näpuga kallitele reaktiividele või keerukatele instrumentidele? Kuid mõnikord võib tõeline "süüdlane" peituda vaikselt nurgas - see näiliselt tavaline puhverreaktiivi pudel. Kuigi see on silmapaistmatu, on see päästerõngas katse täpsuse säilitamiseks. Täna avastame selle "nähtamatu eestkostja" saladuse.
Ⅰ. Puhver: mis see on? Miks on see laboris hädavajalik?
Lihtsamalt öeldes on puhver spetsiaalne lahusesüsteem, mis suudab vastu pidada väikese koguse lisatud happe, leelise või lahjenduse mõjudele ja säilitada lahuse suhteliselt stabiilse pH väärtuse. Tavaliselt koosneb see paarist "partnerist" - nõrk hape ja selle konjugeeritud alus (või nõrk alus ja selle konjugeeritud hape), nagu äädikhape/naatriumatsetaat (HAc/Ac-), naatriumdivesinikfosfaat/dinaatriumvesinikfosfaat (NaHPO₂4PO), mis on levinud jne. laborid.
Põhivõime: stabiliseerida pH-d ja seista vastu muutustele!
Kui katsesse viiakse kogemata väike kogus happelisi või aluselisi aineid, reageerib puhvris olev "partner" kiiresti, nagu tõhus "vesinikioonide väravavaht", absorbeerides või vabastades selle, vältides sellega lahuse pH-väärtuse drastilisi kõikumisi. See võime on oluline paljude biokeemiliste reaktsioonide jaoks, mis sõltuvad konkreetsest pH keskkonnast.
Ⅱ. Laboratoorsed etapid: asendamatu peategelane ja toetav roll
1. Biokeemiliste katsete "elu toetav süsteem":
Ensüümide aktiivsuse uurimine:Enamikul ensüümidel on optimaalne aktiivsus ainult kitsas pH vahemikus. Puhvrid (nagu Tris-HCl, PBS) pakuvad usaldusväärsete tulemuste tagamiseks stabiilset "töölauda" ensüümreaktsioonide jaoks.
Valkude puhastamine ja analüüs:Alates rakkude lüüsist, kromatograafilisest eraldamisest (ioonivahetus, afiinsuskromatograafia) kuni elektroforeesini (nagu SDS-PAGE), valkude kristalliseerimise ja säilitamiseni, on igas etapis vaja spetsiifilise pH-ga puhvrit, et säilitada valgu struktuur, laeng ja lahustuvus ning vältida denaturatsiooni või sadenemist.
Nukleiinhappega manipuleerimine:PCR-reaktsioon, DNA/RNA ekstraheerimine, ensüümi seedimine, ligeerimine, hübridisatsioon ja muud protsessid on pH suhtes äärmiselt tundlikud. Tavaliselt kasutatavad puhvrid nagu TE (Tris-EDTA) võivad stabiliseerida nukleiinhapete struktuuri ja kaitsta neid nukleaaside lagunemise eest.
2. Rakukultuuri hällilaul:Rakukultuuri sööde (nagu DMEM, RPMI) ise on keeruline puhversüsteem (toetub sageli naatriumvesinikkarbonaadi/süsinikdioksiidi süsteemile). Täiendavate puhvrite (nt HEPES) lisamine võib tagada rakkudele stabiilsema pH keskkonna, eriti vedelike vahetamisel, vaatlusel või kui süsinikdioksiidi kontsentratsioon võib kõikuda, et tagada rakkude tervislik kasv.
3. Analüütilise keemia "stabiliseeriv jõud":
Kromatograafiline eraldamine:Kõrgfektiivses vedelikkromatograafias (HPLC) ja ioonkromatograafias (IC) on liikuva faasi pH eraldusefekti peamine kontrollparameeter ning puhvrid (nagu fosfaadid ja atsetaadid) tagavad eraldusprotsessi reprodutseeritavuse.
Tiitrimise analüüs:Mõned tiitrimisreaktsioonid tuleb läbi viia konstantsel pH-tasemel või näidata lõpp-punkti, kui konkreetne pH on saavutatud, ja puhver mängib stabiliseerivat rolli.
Standardlahuste valmistamine:Paljude standardlahuste pH-väärtust tuleb täpselt kontrollida ja aluseks on puhvrid.
Ⅲ. Valik ja kasutamine: palju teadmisi
Valige õige puhversüsteem:
pKa väärtus on võtmetähtsusega:Puhvri efektiivne puhverdusvahemik jääb tavaliselt pKa ± 1 väärtuse vahemikku. Valige kindlasti puhver, mille pKa väärtus on lähedane vajalikule töö-pH-le! Näiteks fosfaati (pKa ~ 7,2) kasutatakse sageli neutraalses pH vahemikus ja Tris (pKa ~ 8,1) kasutatakse sageli aluselises.
Ühilduvus:Mõelge, kas puhvri komponendid segavad teie eksperimentaalset reaktsiooni (nt fosfaat võib segada mõningaid fosforüülimise uuringuid ja boraat võib reageerida suhkrutega).
Ioontugevus ja temperatuur:Ioontugevus mõjutab ensüümide aktiivsust, lahustuvust jne; temperatuurimuutused võivad oluliselt mõjutada puhvrite, nagu Tris, pKa väärtust (Tris on suur pKa temperatuurikoefitsient umbes -0,031/kraadi kohta).
Ⅳ. Tavaliste puhvrite loend
1. PBS puhvriseeria
PBS puhver 1 × (pH 7,4), PBS puhver 10 × (pH 7,4), PBS fosfaatpulber (ilma kaltsiumi- ja magneesiumiioonideta): rakkude pesemine rakukultuuri katsetes (näiteks enne söötme vahetamist); antikehade lahjendamine ja ELISA plaatide pesemine immunoloogiakatsetes; osmootse rõhu ja pH stabiilsuse säilitamine valgu/nukleiinhappe katsetes jne.
DPBS puhver (ilma kaltsiumi ja magneesiumita), DPBS fosfaadi pulber (ilma kaltsiumi- ja magneesiumiioonideta): voolutsütomeetria rakukatsetes, pesemine pärast raku seedimist (et vältida kaltsiumi ja magneesiumi segamist ensüümide aktiivsusega); ensüümide lahjendamine või ioon{0}}tundlike katsete läbiviimine molekulaarbioloogias (nt teatud PCR reaktsioonid) jne.
PBST puhver (1 ×), PBST puhver (10 ×): kasutatakse Western Blot või immunohistokeemia blokeerimiseks ja pesemiseks, mittespetsiifilise seondumise vähendamiseks jne.
2. TBS puhvriseeria
TBS-puhver (1x), TBS-puhver (10x): asendage immunoloogilistes katsetes PBS-puhver (et vältida fosfaatide segamist teatud antikehade seondumisel); stabiliseerida leeliselist pH-keskkonda valgukatsetes jne.
3. HBSS puhvriseeria
HBSS-puhver (kaltsiumi- ja magneesiumivaba, fenoolpunasevaba)/Hanki puhver (kaltsiumi- ja magneesiumivaba): rakkude eraldamine ja tsentrifugaalpesu rakukatsetes (näiteks voolutsütomeetria); lühiajaline-rakkude hooldus (nt elusrakkude pildistamine) jne. HBSS-puhver (kaltsiumi- ja magneesiumivaba, fenoolpunasevaba): säilitab raku metaboolse aktiivsuse rakukultuuris (kaltsium ja magneesium osalevad signaaliülekandes); rakkude migratsiooni/invasiooni katsed.
4. TE puhvriseeriad
TE puhver (1x), TE puhver (10x): lahustage ja säilitage DNA/RNA (Tris säilitab pH, EDTA kelaatib metalliioone, et pärssida nukleaasi aktiivsust); lahjendada DNA-d PCR-i, sekveneerimise ja muude katsete jaoks.
5. Elektroforeesipuhvriseeriad
TAE puhver (1×): tavaline DNA agaroosgeelelektroforees (madal eraldusvõime, sobib suurte DNA fragmentide jaoks). TBE puhver (1×), TBE puhver (10×): kõrge -lahutusvõimega DNA/RNA elektroforees (nt väikesed fragmendid või polüakrüülamiidgeelelektroforees); pikaajaline-elektroforees (puhverdusvõime on parem kui TAE).
6. Western Blot Experiment Buffer Series
Western Blot Transfer Buffer (10×): puhver, mida kasutatakse valkude ülekandmiseks geelist membraanile (näiteks PVDF membraanile), mis sisaldab Tris-i, glütsiini ja metanooli.
Tris-HCl puhver (1 mol/L, pH 6,8): SDS-PAGE kontsentreeritud geeli valmistamine jne.
Tris-HCl puhver (1,5 mol/L, pH 8,8): SDS-PAGE eraldusgeeli valmistamine jne.
7. Standardne pH puhvri seeria
pH=4.00/6,86/9,18 puhver (valmistatud 250 ml): standardlahus pH-meetri kalibreerimiseks (nt pH 6,86 on neutraalne standard, pH 4,00 ja 9,18 on happelised ja aluselised standardid).
Puhverreaktiivid ei ole laboris mingil juhul põhiline toetav roll. Nende põhiväärtus seisneb täpse ja stabiilse prootonikeskkonna tagamises, mis on enamiku biokeemiliste reaktsioonide termodünaamilise tasakaalu ja kineetilise kiiruse säilitamise nurgakivi. Alates ensüümi aktiivsete saitide mikrokeskkonna reguleerimisest kuni biomakromolekulide konformatsioonilise stabiilsuse tagamiseni kuni transmembraansete ioonide gradientide säilitamiseni on puhversüsteemi pH puhverdusvõime vältimatu eeldus katseandmete korratavuse ja usaldusväärsuse tagamiseks. Beekman saadab teid teie teaduslikule uurimisreisile.
Hunan BKMAM Holding Co., Ltd
Veebisait: www.bkmbio.com
E-post:info@bkmbio.com